Katalog No: DiaRD - MTB ÇİD

DiaRD-MTB/ÇİD Rt PCR kiti klinik örneklerde M. tuberculosis kompleks varlığı yanında rifampisin (RİF) ve izoniazid (INH) direncini araştırmak için gerekli tüm bileşenleri bulunduran iki aşamalı gerçek zamanlı multipleks polimeraz zincir reaksiyon (real-time polymerase chain reaction, Rt PCR) temelli moleküler tanı kitidir. Kit iki ayrı multipleks Rt-PCR uygulaması içermektedir. Birinci uygulamada klinik örneklerde M. tuberculosis varlığı ve RİF direnci araştırılmaktadır. Tüberküloz tanısı için M. tuberculosis kompleks suşlarında bulunan IS6110 geni içerisindeki 200 baz çiftlik bölgenin amplifikasyonunu sağlayan primerler ve çoğalmayı saptayacak florofor boya ve baskılayıcı ile işaretli molecular beacon prob bulunmaktadır. Rifampisin direnci, dirençten sorumlu rpoB gendeki 81 bazlık bölgede yer alan mutasyonları kapsayacak wild-type diziye spesifik üç ayrı boya ile işaretli molecular beacon problarla belirlenmektedir. Birinci uygulamada RİF dirençli M. tuberculosis saptanan örneklerde INH direncinin araştırılması için ikinci multipleks Rt PCR gerçekleştirilmektedir.

İkinci Rt-PCR uygulamasında M. tuberculosis kompleks spesifik prob/primerler yanında INH direncinden sorumlu katG ve inhA genlerindeki mutasyonları belirlemek için tasarlanmış wild tip dizilere özgü problar ve ilgili gen bölgelerini çoğaltmak için gerekli primeler bulunmaktadır.  Örneklerde M tuberculosis kompleks bulunması durumunda IS6110 için spesifik olan prob hedef bölgeye tutunmakta ve böylece baskılayıcıdan kurtulan florofor boya floresan vermektedir.

Oluşan floresan sinyalleri amplifikasyon süresince toplanmakta ve amplifikasyon grafikleri halinde rapor edilmektedir. Rifampisin ve INH direnci bulunmayan suşlarda M. tuberculosis spesifik primer/prob, internal kontrol ve wild-type spesifik olarak tasarlanmış rpoB, katG ve inhA primer/prob kanallarından pozitif sinyal alınmaktadır. Suş dirençli ise M. tuberculosis spesifik boya kanalı ve internal kontrol kanallarından pozitif sonuçlar alınırken wild-type spesifik olarak tasarlanmış primer/prob kanalından sinyal alınmayacak veya IS6110 kanalına göre RİF direncini araştıran problardan en az 5 Ct (cycle threshold) daha geç ve RFU değeri en az 300 birim daha düşük sinyaller alınacaktır. INH direncini araştırmak için tasarlanan wild tip problarla dirençli suşlarda sinyal alınmayacak veya RFU değeri 200’ün altında kalacaktır. 

Kit kapsamında, olası PCR inhibitörlerin tespitini sağlamak için RNazP genine özgü primer/problar bulunmaktadır. Pozitif kontrol olarak M. tuberculosis H37Ra suşundan izole edilmiş 1.0x10e4 kopya/mL olan DNA, negatif kontrol olarak steril PCR kalitesinde su bulunmaktadır.